Cảm ơn Hưng nhé, nhưng mà mình vướng chủ yếu ở khâu tách chiết Mt DNA và các mẫu đã bị phân huỷ. Còn multi C ở trình tự của ADN ti thể thì mình sẽ học kinh nghiệm của Hưng vậy.
Trước em có làm ở phòng CNTBDV, nơi chú Lê Quang Huấn rất thành công trong tách chiết DNA ty thể từ các mẫu hài cốt liệt sỹ (thường được chôn cất không có áo quan, ở các điều kiện dễ phân hủy và qua hàng chục năm), nhưng đều đã làm rất thành công. Bác qua đó trao đổi chắc sẽ xử lý được vấn đề.
Về sequencing các template "không bình thường" nhân tiện em tổng kết 1 số cái em học lóm được tại đây, hy vọng giúp được bác
1. Trình tự giàu G/C
- Bổ sung DMSO (2%-5%) vào sequencing reaction.
- Bổ sung betain (5%) vào sequencing reaction.
- Tăng melting temperature trong phản ứng PCR đọc trình tự
- Bổ sung thêm Taq, dNTP hoặc dùng dGTP Big Dye kit (ở đó họ thay dGTP bằng dITP) trong phản ứng PCR đọc trình tự.
2. Trình tự chứa cấu trúc bậc hai --> đọc được 1 đoạn ngắn thì bị ngắt đột ngột, cái này nhìn pic từ kết quả đọc trình tự biết ngay
- Xử lý bằng các cách áp dụng cho trường hợp 1
3. Trình tự chứa homopolymer region (ví dụ poly C, poly T...)
- Tăng nồng độ Taq trong phản ứng đọc trình tự
- Thiết kế primer gắn bổ sung với vùng homopolymer (tuy nhiên nhược điểm là không xác định được độ dài của của homopolymer trong trình tự cần đọc)
Có một cách khác rất hiệu quả để xử lý các trình tự khó là transcriptional sequencing nhưng không dễ áp dụng. Nếu bác quan tâm thì search pubmed sẽ thấy.
Good luck.