What's new

GeneJET™ PCR Cloning Kit

#1
Không biết có bác nào dùng kit này chưa nhỉ, chẳng biết hiệu quả thực hư ra sao
...
The GeneJET™ PCR Cloning Kit is an advanced positive selection system for the highest efficiency cloning of PCR products generated with any DNA polymerase. The kit offers cloning efficiencies of up to 100% positive clones, eliminating the need for tedious colony screening. The kit is specifically designed to ligate PCR products into a positive selection vector in just 5 minutes. Purification of PCR products is not required.
Blunt-end PCR products generated with a proofreading DNA polymerase (e.g., Pfu DNA polymerase) are directly ligated into the cloning vector. PCR products generated either with non-proofreading DNA polymerases (e.g., Taq DNA polymerase) or with mixtures of DNA polymerases are blunted in 5 minutes prior to ligation.
All common laboratory E.coli strains can be directly transformed with the ligation product*. The recommended efficiencies of competent cells are 107cfu/µg and higher. This level of transformation efficiency is easily achieved with the TransformAid™ Bacterial Transformation Kit.
The GeneJET™ PCR Cloning Kit includes a novel, ready-to-use positive selection cloning vector pJET1/blunt (see Fig.1). pJET1/blunt is a positive selection vector, therefore only recombinant plasmids containing the insert DNA are propagated after transformation into E.coli. Recircularized pJET1/blunt vector molecules lacking the insert express a lethal restriction enzyme after transformation, killing the host E.coli cell. The positive selection drastically accelerates the process of colony screening and eliminates additional costs of expensive reagents IPTG and X-Gal required for cloning into vectors with blue/white selection.
...
_h2tp://www.fermentas.com/catalog/kits/genejetpcrclon.htm
 

Cao Xuân Hiếu

Administrator
Em bảo bọn công ty đưa cho 1 ít mà test thử. Cái quan trọng là hiệu suất ligation của kit chứ mấy cái kiểu chọn lọc /biển nạp chỉ tiện dụng hơn chứ không phải tăng hiệu suất. Lưu ý sử dụng cái kit mỳ ăn liền 5min thì nếu ủ quá thời gian (vd overnight) thì hiệu suất có thể giảm đấy. Bọn fermentas này chẳng đưa ra đường động học của T4 ligase mà gộp cả vào hiệu suất cloning cuối cùng nên cũng nhiều thủ thuật lắm. Ngoài ra còn gián tiếp so sánh với các kit của Invitrogen để thấy hiệu suất gấp 4 lần. Khó tin lắm, phải thử mới biết.
 
.Cái hay là ở chỗ không phải chọn xanh trắng gì nữa, trải đĩa xong, có con nào mọc là OK luôn "cào là trúng" :oops:
.Bọn nó kiểm tra chán chê rồi thì mới dám công bố vậy, hy vọng không phải là tiểu xảo. Mà thêm nữa, bọn fer này còn đưa ra cả các enzym cắt chỉ mất có 5 phút ủ, nhanh thật, cái gì cũng 5 phút ?:lol: ?
Mà đại ca Hiếu đến từ AD hay ADT ấy nhỉ ?8) ?, trông cứ mờ mờ ảo ảo
 

Dương Văn Cường

Administrator
Cái hay là ở chỗ không phải chọn xanh trắng gì nữa, trải đĩa xong, có con nào mọc là OK luôn "cào là trúng"
Anh cho rằng đó là cái dở mới đúng. Sau khi trải đĩa em không thu được bất kỳ khuẩn lạc nào, vậy em kết luận sao? Trường hợp có khuẩn lạc xanh thì đó chính là positive control để chứng minh bộ KIT của em chưa hỏng.

Ligation time = 5 minutes đúng là một điểm mới lạ (lần đầu tiên anh biết điều này) và rất có ích. Với những thí nghiệm cloning mà phải digest = 2 enzymes mà lại kô thể digest đồng thời, sau đó còn elute nữa thì thời gian từ sáng đến đêm chưa chắc đã kịp. Nếu chỉ mất 5' ligate thì "dễ thở" hơn nhiều.

Purification of PCR products is not required: Rất hay, đỡ phiền và tiết kiệm (tiền cho 1 phản ứng purification có khi bằng cả một phản ứng ligation), đỡ lo mất mẫu trong những trường hợp mẫu không nhiều.
 
@ anh Cường
? 1. Anh đã khi nào trải được đĩa toàn khuẩn lạc xanh chưa? Chắc là chưa nhỉ? Nếu toàn ra xanh thì anh tính sao? Em nghĩ "Sau khi trải đĩa em không thu được bất kỳ khuẩn lạc nào" khó xẩy ra lắm, nhất là do kit. Kit thì không hỏng nhưng mình làm hỏng nó lúc thí nghiêm thôi ?:lol:. Mà trong kit của bọn Fer có phản ứng đối chứng đấy.
? 2.Còn về ligation 5 phút em tưởng có lâu rồi, hehe dùng topoisomerase
...
TOPO® Technology presents a faster, more efficient way to clone PCR products. You’ll save time, effort, and get the recombinant clones you need for downstream experiments. The key to TOPO® Cloning is the enzyme DNA topoisomerase I, which functions as both a restriction enzyme and a ligase. Its biological role is to cleave and rejoin DNA during replication. To harness the religating activity of topoisomerase, over 30 vectors are provided linearized with topoisomerase I covalently bound to each 3' phosphate. This enables fast ligation of DNA sequences with compatible ends. After only 5 minutes at room temperature, the ligation is complete and ready for transformation into E. coli.
... ?
? 3.Bình thường lúc ligation, em chẳng tinh sạch bắng kit bao giờ => cho nó nhanh hehe, nhiều lắm là tủa cồn. Mà dùng kit tin sạch, em thấy hiệu quả nó quảng cáo cao lắm cơ mà, kit rẻ tiền như promega mà còn thế này:
DNA Fragment Size ? ? Percent Recovery
55bp ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?26%
70bp ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?39%
85bp ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?55%
100bp ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?84%
500bp ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?89%
1,000bp ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 92%
3,199bp ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 95%
9,416bp ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 95%
23,130bp ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 47%
?Hơn nữa chỉ dùng mấy ul cho 1 phản ưng ligation thôi mà.
 

Dương Văn Cường

Administrator
1. Umh, đúng là chưa khi nào có đĩa toàn khuẩn lạc xanh cả  :mrgreen:  nhưng trường hợp có rất ít khuẩn lạc trắng thì không phải là hiếm. Sử dụng kit xanh - trắng có thể giúp mình hoàn thiện kỹ thuật hơn. Chẳng hạn như lúc ligate lấy enzyme kô chuẩn (cảm giác), hoặc những sai sót nhầm lẫm nho nhỏ trong các thao tác, có thể tỉ lệ xanh-trắng sẽ giúp ta hình dung tốt hơn. Cái dở có lẽ là ở khâu trải X-gal vì ... ngại

2. Vụ ligation anh bị nhầm, dạo này đang thiết kế vector biểu hiện nhiều nên lẫn lộn hết cả. Em đang nói về cloning PCR product thì anh lại nghĩ sang ligation = T4. Nhân tiện hỏi luôn có bác nào dùng topoisomerase hay đại loại 1 enzyme khác để thay thế cho T4 chưa nhỉ?

3. Em có thể test bằng cách điện di so sánh và đo nồng độ DNA trước và sau khi tinh sạch. Điện di thì thường là sẽ thấy mờ đi 1 tí, còn đo nồng độ thì anh có làm thử 1 lần, trước tinh sạch là khoảng 220ng/ul còn sau tinh sạch là khoảng 190 (con số chính xác anh kô nhớ vì chỉ là test nghịch, kô ghi sổ). Cột của hãng gì cũng kô nhớ nốt  :oops:

===

Chi viết lách cái gì đó để đăng lên trang nhất đi.
 

Cao Xuân Hiếu

Administrator
Vũ Hải Chi said:
.Cái hay là ở chỗ không phải chọn xanh trắng gì nữa, trải đĩa xong, có con nào mọc là OK luôn "cào là trúng" :oops:
.Bọn nó kiểm tra chán chê rồi thì mới dám công bố vậy, hy vọng không phải là tiểu xảo. Mà thêm nữa, bọn fer này còn đưa ra cả các enzym cắt chỉ mất có 5 phút ủ, nhanh thật, cái gì cũng 5 phút  :lol:  
Mà đại ca Hiếu đến từ AD hay ADT ấy nhỉ  8)  , trông cứ mờ mờ ảo ảo
Giờ mới để ý hóa ra là đồng môn. Cường thêm cho anh chữ T vào cho nó chuẩn nhé.

Bọn Fermentas có RE tại RT 5min ah? Chẳng tin. Còn nếu nói cái blunting enzyme trong kit này thì chỉ là cái exonuclease và có thể mix thêm với phosphatase thôi.

Như Cường cũng nói đó, nếu đầu tư tiền vào để đánh xổ số cào biết ngay kết quả thì có tốn kém k? Phải xem hoạt tính T4 ligase của bọn này có nguồn gốc ntn? Đã có nhiều cty sản xuất T4 ligase tại RT 5min từ lâu rồi chứ bọn Fermentas ko phải đầu tiên.

Cái việc dùng enzyme gây chết để hạn chế chọn lọc dương giả cũng ko phải là chỉ có mỗi kit này đâu. Do đó ngoài việc so sánh hiệu suất, giá cả còn phải tính toán đến nhu cầu sử dụng thực tế của project hoặc lab để mà chi tiêu cho hợp lý.

Nói thật, nhiều lúc dùng kit 5min ko ra anh toàn phải quay về T4 ligase trên nước đá của chú NVH để cho chắc ăn. Dạo này bỏ nghề proteomics quay về DNA và RNA chơi rùi .

. Vụ ligation anh bị nhầm, dạo này đang thiết kế vector biểu hiện nhiều nên lẫn lộn hết cả. Em đang nói về cloning PCR product thì anh lại nghĩ sang ligation = T4. Nhân tiện hỏi luôn có bác nào dùng topoisomerase hay đại loại 1 enzyme khác để thay thế cho T4 chưa nhỉ?
Xem bọn Biocompare nó nói về TOPO của Invitrogen này. Tôi chỉ thấy bọn này bi cái đắt chứ kit XL cloning của nó thì đoạn 2-3kb nhét vào vẫn vô tư.
http://www.biocompare.com/review/10/Invitrogens-TOPO-TA-CloningTM-Kit.html

Mong muốn của tôi là xây dựng SHVN theo hướng Biocompare nhưng mà ...

Bình thường lúc ligation, em chẳng tinh sạch bắng kit bao giờ => cho nó nhanh hehe, nhiều lắm là tủa cồn. Mà dùng kit tin sạch, em thấy hiệu quả nó quảng cáo cao lắm cơ mà, kit rẻ tiền như promega mà còn thế này
nên phải làm sạch. Chạy qua cột chỉ mất có 5min (lại 5min :D ) chứ tủa cồn lại phải mất 30min. Mà chạy cột thì nên dùng của bọn Roche, ăn nhau ở cái màng giữ DNA.

Lưu ý khi trong cloning sau mỗi bước dùng enzyme thì nên biến tính đi rồi mới làm pư kế tiếp. Nhất là trước khi biến nạp bằng xung điện.

(PS: tôi sẽ ko online trong 2 tuần tới)
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Ligation time = 5 minutes đúng là một điểm mới lạ (lần đầu tiên anh biết điều này) và rất có ích. Với những thí nghiệm cloning mà phải digest = 2 enzymes mà lại kô thể digest đồng thời, sau đó còn elute nữa thì thời gian từ sáng đến đêm chưa chắc đã kịp. Nếu chỉ mất 5' ligate thì "dễ thở" hơn nhiều.
Có thể tăng enzyme lên để digest cho nhanh. Chỉ cần 1h là đủ cho 1 phản ứng digest, cộng với ligation nữa thì cũng chỉ mất buổi sáng. Chiều là biến nạp được, đâu có mất từ sáng tới đêm đâu.

1. Anh đã khi nào trải được đĩa toàn khuẩn lạc xanh chưa? Chắc là chưa nhỉ? Nếu toàn ra xanh thì anh tính sao? Em nghĩ "Sau khi trải đĩa em không thu được bất kỳ khuẩn lạc nào" khó xẩy ra lắm, nhất là do kit. Kit thì không hỏng nhưng mình làm hỏng nó lúc thí nghiêm thôi
Để tránh trường hợp này có thể dùng Alkaline Phosphatase sau khi digest bằng RE.


2.Còn về ligation 5 phút em tưởng có lâu rồi, hehe dùng topoisomerase

2. Vụ ligation anh bị nhầm, dạo này đang thiết kế vector biểu hiện nhiều nên lẫn lộn hết cả. Em đang nói về cloning PCR product thì anh lại nghĩ sang ligation = T4. Nhân tiện hỏi luôn có bác nào dùng topoisomerase hay đại loại 1 enzyme khác để thay thế cho T4 chưa nhỉ?
Đúng rồi. Kit TOPO đó. Nhưng 5 phút chỉ cho sticky end thôi, blunt end thì cần dài hơn. Nói đến kit TOPO lại nhớ có đồng chí dùng kit này mà vẫn cho T4 ligase hehe.

Bọn Fermentas có RE tại RT 5min ah
Cái này đúng đấy bác ạ.

Lưu ý khi trong cloning sau mỗi bước dùng enzyme thì nên biến tính đi rồi mới làm pư kế tiếp
Không nhất thiết. Nhất là khi digest bằng 2 RE thì sau khi dùng RE thứ nhất dùng luôn RE thứ 2 không cần bất hoạt.

Nói chung làm theo kit nào, protocol nào cũng đều có ưu nhược riêng. Tùy từng trường hợp, đối tượng mà chọn thôi.
 
1.Có thể tăng enzyme lên để digest cho nhanh.
2.Để tránh trường hợp này có thể dùng Alkaline Phosphatase sau khi digest bằng RE.
1.Tăng thế nào là đủ ?:?:
2.Nếu không xử lý bằng Alkaline Phosphatase, chắn cũng không ra được 1 đĩa toàn khuẩn lạc xanh đâu, hoặc không mọc :oops: ?hoặc xanh trắng lẫn lộn thôi.
*.Khi dùng 2 RE có pH + [salt] khác nhau, các bác xử lý thế nào nhỉ ?
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
1.Tăng thế nào là đủ  
Thường thì còn tùy vào DNA concentration, loại enzyme, muốn giảm bao nhiêu thời gian. Nhưng ít nhất cũng phải tăng gấp 2 lần. Cứ làm thực nghiệm khắc biết.

2.Nếu không xử lý bằng Alkaline Phosphatase, chắn cũng không ra được 1 đĩa toàn khuẩn lạc xanh đâu, hoặc không mọc   hoặc xanh trắng lẫn lộn thôi.
Có đấy, nhất là khi làm blunt-ended cloning.

*.Khi dùng 2 RE có pH + [salt] khác nhau, các bác xử lý thế nào nhỉ ?
Đơn giản là tinh sạch sau khi digest với RE thứ nhất rồi làm tiếp với RE thứ 2 thôi. Chú ý digest với RE cần [salt] thấp hơn trước.
 
Cái Topoisomerase I này có nhiều loại, nhận diện nhiều vị trí hay chỉ nhận diện 1 trình tự? Nếu chỉ nhận diện 1 trình tự chẳng lẽ nó chỉ dùng được cho 1 loại cloning vector do công ty thiết kế thôi à?
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Cái Topoisomerase I này có nhiều loại, nhận diện nhiều vị trí hay chỉ nhận diện 1 trình tự? Nếu chỉ nhận diện 1 trình tự chẳng lẽ nó chỉ dùng được cho 1 loại cloning vector do công ty thiết kế thôi à?
Đúng là bọn Topoisomerase I này chỉ nhận diện 1 trình tự nhưng cái hay là ở chỗ đấy. Bọn hãng nó dùng Vaccinia virus topoisomerase I, với trình tự nhận biết là 5´-(C/T)CCTT-3´. Do vậy chúng gắn enzyme này với nhóm phosphate của 3'T tại đầu của vector mạch thẳng. Ngay sau cái đầu 3'T này là vị trí nhận biết của Vaccinia virus topoisomerase I.

Như vậy thằng enzyme này luôn ở trạng thái "trung gian" (mọi Topoisomerase đều có 2 hoạt tính là cắt sau đó nối lại, ở dây theo cách thiết kế này thì thằng ku Vaccinia virus topoisomerase I đã thực hiện xong nhiệm vụ cắt). Ngay khi có sản phẩm PCR (với đầu A thò ra) gắn với đầu 3'T của vector thì topoisomerase I sẽ thực hiện nhiệm vụ còn lại là nối. Do vậy có thể dùng cho bất cứ chú nào có đầu A thò ra.

Ngoài ra nó còn nhiều kit biến thể khác với thằng Topo này ở đầu. Bọn hãng giỏi thật!!!
 
1.Thường thì còn tùy vào DNA concentration, loại enzyme, muốn giảm bao nhiêu thời gian. Nhưng ít nhất cũng phải tăng gấp 2 lần. Cứ làm thực nghiệm khắc biết.
:D
Thế phải tăng bao nhiêu lần để cắt xong trong 5 phút?

2.Có đấy, nhất là khi làm blunt-ended cloning.
Hơ hơ, chắc đại ca quên cho sản phẩm PCR vào rồi :p, khi nào làm được một đĩa toàn xanh thì cho em xem mới nhé.
 
Sau 1 thời gian tiến hành thực nghiệm với GeneJET PCR Cloning Kit mình có 1 số đánh giá (so với TA Kit của Invitrogen):

1. Ưu điểm:
- Hiệu quả chọn dòng cao.

2. Nhược điểm:
- Việc ligation phức tạp nếu sử dụng nonproofreading DNA polymerases (Taq...) để PCR, để khắc phục ta có thể sử dụng proofeading DNA polymerases để tạo ra các sản phẩm PCR đầu bằng, nhưng các proofeading thường có giá cao hơn.
- Mồi đọc trình tự quá gần đoạn DNA chèn vào (ở phiên bản cải tiến CloneJET, mồi đọc này đã được đưa ra xa hơn một chút) dẫn đến kết quả đọc không ổn lắm.
- Không biết chất lượng của DNA blunting enzyme trong bộ kit ra sao, theo quan sát chủ quan, tôi thấy một số trường hợp "đoạn DNA chèn vào bị mất phần đầu khoảng 30-60 nu", nên đối với những trường hợp nhân dòng trung gian mà trên mồi PCR có thiết kế thêm điểm cắt thì việc sử dụng vector này cần được chú ý.
- Tính ổn định không cao.
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Sau 1 thời gian tiến hành thực nghiệm với GeneJET PCR Cloning Kit mình có 1 số đánh giá (so với TA Kit của Invitrogen):

1. Ưu điểm:
- Hiệu quả chọn dòng cao.

2. Nhược điểm:
- Việc ligation phức tạp nếu sử dụng nonproofreading DNA polymerases (Taq...) để PCR, để khắc phục ta có thể sử dụng proofeading DNA polymerases để tạo ra các sản phẩm PCR đầu bằng, nhưng các proofeading thường có giá cao hơn.
- Mồi đọc trình tự quá gần đoạn DNA chèn vào (ở phiên bản cải tiến CloneJET, mồi đọc này đã được đưa ra xa hơn một chút) dẫn đến kết quả đọc không ổn lắm.
- Không biết chất lượng của DNA blunting enzyme trong bộ kit ra sao, theo quan sát chủ quan, tôi thấy một số trường hợp "đoạn DNA chèn vào bị mất phần đầu khoảng 30-60 nu", nên đối với những trường hợp nhân dòng trung gian mà trên mồi PCR có thiết kế thêm điểm cắt thì việc sử dụng vector này cần được chú ý.
- Tính ổn định không cao.
Còn một nhược điểm nữa hình như là cut check kiểm tra thường phải dùng 2RE chứ không tiện như kit TA chỉ dùng 1 phát EcoR I.
 

blog viet

New member
Thằng fermentas có mấy sp dùng cũng được phết các bác ạh! nhưng nói thiệt: Đắt quá đáng,tất nhiên với mấy cái sp mới thui. mà nó lại hơi mới. Tui thấy các bác cứ mua đóng gói nhỏ mà dùng thử xem có ok không đã.:???:
 

Facebook

Top