What's new

Nhiệt độ trong PCR

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Bà con bàn tán xôm tụ quá hehe, góp vui tí nhé.

Biến tính 95 dộ trong 3 phút,
Chạy 30 vòng theo thông số sau:
- Biến tính 95 độ trong 2 phút
- kết dính 45 độ trong 2 phút
- tổng hợp ở 68 độ trong 3 phút
Mọi người phân tích kỹ rồi không đá lại nữa. Chỉ muốn nói là phương pháp PCR nó muôn hình vạn trạng lắm, có đủ thứ chu trình kỳ quái cho nên mọi người cũng không nên quá chỉ trích người đặt ra chu trình nhiệt này.

1. Bài tập cho sinh viên và mục đích chính là phân tích cái nhiệt độ gắn mồi khác nhau, nên có thể thầy lơ đễnh các bước khác.

2. Chu trình nhiệt bất thường như vậy khiến sinh viên thắc mắc mà đi tìm hiểu, sẽ rõ ra vài điều. Chả thế mà các bác và cả em mới có chỗ bàn ra bàn vào còn gì.

3. Mọi người tập trung chỉ trích cái bước gắn mồi 2 phút nhưng thật ra trên thực tế khi primers quá ngắn (ví dụ chỉ 10 mer) người ta sẽ tăng thời gian gắn mồi lên và 2 phút là con số thực tế đã có người thực hiện trong differential display PCR. Ngoài ra khi template ở dạng mạch đơn cũng nên tăng thời gian gắn mồi. Mà 2 phút thì đã ăn thua gì, mọi người vào xem chu trình nhiệt của cái kit này (thường dùng khi tạo knock-out constructs) http://catalog.takara-bio.co.jp/en/product/basic_info.asp?unitid=U100005643

94°C, 1 min.

14 cycles
98°C, 20 sec.
68°C, 20 min.

16 cycles
98°C, 20 sec.
68°C, 20 min. + 15 sec./cycle*
72°C, 10 min.

Tất nhiên cũng không ngoài khả năng người ra đề không vững thực nghiệm nhưng chỉ vì một chu trình nhiệt không kèm các dữ liệu như template, primers.... mà kết luận như vậy hơi nặng.

Thật ra khi nhòm chu trình nhiệt của thầy giáo ra chỉ thắc mắc ở bước "95 độ trong 2 phút" thôi, lại những 30 chu kỳ.

Ngoài ra kết quả PCR còn phụ thuộc vào loại tube sử dụng (thành mỏng hay dày, thể tích tube, thể tích phản ứng), máy PCR (thực chất là tốc độ gia nhiệt và khả năng giữ nhiệt).

Túm lại khi học về phương pháp PCR thì nên hiểu lý thuyết và ý nghĩa các bước, còn khi làm thì nên quên nó đi, chỉ có thực nghiệm mới trả lời được thôi vì có quá nhiều biến ảnh hưởng đến kết quả PCR. Riêng tui thì thích kỹ thuật này nhất trong tất cả những kỹ thuật mà tui biết vì nó quá đa dạng và đa năng, bạn có thể tạo đột biến thay thế nucleotide, chèn vào (hoặc cắt bớt đi) 1 hoặc một số nucleotide, nối 2 hoặc nhiều đoạn với nhau... Nói chung chỉ với PCR hoàn toàn có thể tạo ra 1 đoạn trình tự bất kỳ theo ý mình. Thậm chí giờ người ta còn dùng PCR để tổng hợp genome của 1 virus hoàn toàn mới.
 

Dương Văn Cường

Administrator
94°C, 1 min.

14 cycles
98°C, 20 sec.
68°C, 20 min.

16 cycles
98°C, 20 sec.
68°C, 20 min. + 15 sec./cycle*
72°C, 10 min.
68°C, 20 min ở đây không phải chỉ dành riêng cho nhiệt độ gắn mồi mà bao gồm cả nhiệt độ gắn mồi và nhiệt độ kéo dài dùng cho phản ứng PCR có độ dài sản phẩm lớn. Ở phần trên của trang web có nhắc đến độ dài sản phẩm:

Template: human genome DNA 500 ng/50 µl
Applied volume: each 5 µl
PCR products size Lane 1 : λ-Hind III digest
2 : 17.5 kbp (β-globin cluster)
3 : 21.5 kbp (β-globin cluster)
4 : 27 kbp (tPA)
5 : High MW DNA Marker (Invitrogen)
Độ dài sản phẩm từ 17.5 đến 27kb. DNA polymerase được sử dụng ở đây là TaKaRa LA Taq™. Người ta không cung cấp tốc độ tổng hợp của enzyme này nên ta không tính được chính xác. Tuy nhiên một phiên bản khác của Taq thì tốc độ tổng hợp chắc cũng same same, khoảng 1kb/s, do đó mình cho rằng trong tổng số 20 phút ở 68°C thì chỉ có 30s dành cho gắn mồi, còn lại là dành cho extension.

Chính ra chơi 1 nhiệt độ gộp cả 2 bước hơi bị hay của nó nhể :socool:

Có lần mình đọc là mix Taq với 1 cái DNA polymerase khác thì khả năng khuếch đại đoạn DNA kích thước lớn và độ chính xác tăng vọt hàng chục hàng trăm lần. Tài liệu đó có cung cấp paper nhưng lười không đọc :oops: Anh em nào rõ chỗ này thì giải thích thêm nhé.
 

caibinhbong

New member
Cám ơn các anh chị nhưng em vẫn chưa thấy câu trả lời của em là khi nào người ta dùng nhiệt độ 45 khi nào 52 ở bước kết dính?
 
Anh ví dụ cho dễ hiểu:
Em chạy PCR để khyuếch đại một đoạn nào đó lên để em làm việc với nó.
Muốn khuyếch đại em đoạn cần biết em cần có mồi, vừa là để cho phản ứng tổng hợp gene xảy ra được, vừa xác định trình tự sẽ được khuyếch đại (chính là trình tự kẹp giữa 2 cái mồi).
Giả sử có cùng một cặp mồi đó và cùng một nguyên liệu là DNA của một sinh vật nào đó, em sẽ tính toán được nhiệt độ tối ưu (lý thuyết) để "kết dính". Nhưng khi em sử dụng nhiệt độ này không thấy có kết quả. Sau khi loại trừ các yếu tố khác, em xác định có thể là do trình tự mồi chưa chắc đã khớp với trình tự đoạn gene em cần khuyếch đại. Thế là em sẽ giảm dần nhiệt độ từ T tối ưu xuống T thấp hơn cho đến khi nào em ra được sản phẩm thì thôi. Đó có lẽ là ý cho câu hỏi của thầy em đó.

Làm việc với PCR có năm bảy kiểu làm việc. Như các lab ở mình thì gene đã có sẵn trong vector chỉ việc câu ra thôi. Hoặc screen thì cũng vẫn chính cặp mồi đó. Nếu làm Southern kiểm tra vị trí insert thì thêm mồi nằm ngoài nữa nên nói chung đk PCR tương đối đơn giản.
Đối với các trường hợp làm Genotyping hoặc các kỹ thuật kiểu Differential display PCR hay competitive PCR (giờ bị Real-time nó thay hoàn toàn rồi) thì nói chung xếp vào loại không kinh điển và các đk chạy "quái dị" là chuyện bình thường.
@Cường. Cái vụ mix Taq với Pfu hay một proof-reading nào đó thì Long-range PCR vẫn thường làm mà

Tái bút: Cho những ai thực sự muốn tìm hiểu những thông tin cơ bản nhất, nhưng cũng toàn diện nhất về PCR:
http://rapidshare.com/files/214053150/PCR__The_Basics__2nd_Ed.rar
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
68°C, 20 min ở đây không phải chỉ dành riêng cho nhiệt độ gắn mồi mà bao gồm cả nhiệt độ gắn mồi và nhiệt độ kéo dài dùng cho phản ứng PCR có độ dài sản phẩm lớn. Ở phần trên của trang web có nhắc đến độ dài sản phẩm:
Đúng rồi nhưng 68 độ vẫn là nhiệt độ gắn mồi và 20 phút vẫn là thời gian của bước gắn mồi hihi. Gộp 2 bước gắn mồi và khuếch đại vẫn thường được làm mà.
 

caibinhbong

New member
Anh ví dụ cho dễ hiểu:
Em chạy PCR để khyuếch đại một đoạn nào đó lên để em làm việc với nó.
Muốn khuyếch đại em đoạn cần biết em cần có mồi, vừa là để cho phản ứng tổng hợp gene xảy ra được, vừa xác định trình tự sẽ được khuyếch đại (chính là trình tự kẹp giữa 2 cái mồi).
Giả sử có cùng một cặp mồi đó và cùng một nguyên liệu là DNA của một sinh vật nào đó, em sẽ tính toán được nhiệt độ tối ưu (lý thuyết) để "kết dính". Nhưng khi em sử dụng nhiệt độ này không thấy có kết quả. Sau khi loại trừ các yếu tố khác, em xác định có thể là do trình tự mồi chưa chắc đã khớp với trình tự đoạn gene em cần khuyếch đại. Thế là em sẽ giảm dần nhiệt độ từ T tối ưu xuống T thấp hơn cho đến khi nào em ra được sản phẩm thì thôi. Đó có lẽ là ý cho câu hỏi của thầy em đó.

Nhưng trên lớp bạn em cũng trả lời vậy nhưng thầy em kô chịu. Thầy nói, đang từ nhiệt độ 52 độ xuống 45 độ nếu mỗi lần giảm 1 độ thì phải làm 8 lần x 3 lần lặp lại là 24 lần, mình đâu có tiền và thời gian để làm chuyện đó. Thầy nói, bằng cơ sở khoa học chẳng hạn như nhìn vô trình tự mồi, trình tự khuôn là ngừi ta có thể quyết định ngay. Thầy bảo tìm cái cơ sở khoa học đó,
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Nhưng trên lớp bạn em cũng trả lời vậy nhưng thầy em kô chịu. Thầy nói, đang từ nhiệt độ 52 độ xuống 45 độ nếu mỗi lần giảm 1 độ thì phải làm 8 lần x 3 lần lặp lại là 24 lần, mình đâu có tiền và thời gian để làm chuyện đó. Thầy nói, bằng cơ sở khoa học chẳng hạn như nhìn vô trình tự mồi, trình tự khuôn là ngừi ta có thể quyết định ngay. Thầy bảo tìm cái cơ sở khoa học đó,
Nếu thầy bạn nói thế thì tư duy hơi nhỏ lẻ.

1. Không biết mục đích PCR để làm gì mà phải lặp lại 3 lần?

2. Cho dù có lặp 3 lần, làm 8 lần thì mới có 24 phản ứng, dùng máy gradient hoặc lên viện CNSH nhờ 8 cái máy không gradient thì mất bao nhiêu thời gian đâu. Về tiền thì đắt nhất chỉ có polymerase thôi mà ở VN giờ nhiều nơi làm được lắm, đến xin không cũng được.

3. Cho dù tư duy có nhỏ lẻ người ta cũng sẽ không làm theo kiểu giảm từng độ như thế. Chạy 52 độ không được mà nghi do nhiệt độ gắn mồi quá cao thì ít ra cũng phải giảm 3-5 độ mỗi lần.

4. Những cái thầy bạn dùng để lý luận không có trong đề bài. Nếu giải thích như thầy bạn thì đề bài cần cho thêm điều kiện là không có tiền, không có thời gian, chỉ có mỗi 1 cái máy PCR......
 
Cám ơn các anh chị nhưng em vẫn chưa thấy câu trả lời của em là khi nào người ta dùng nhiệt độ 45 khi nào 52 ở bước kết dính?
thì mọi người đã nói rồi đấy , độ dài của primer ảnh hường đến nhiệt đọ kết dính, 52 độ thì mồi dài hơn mồi ở 42 độ
thi cứ nói như thầy bạn, nhìn vào độ dài hay trình tự của Primer để setup nhiệt độ ...:banbo:
 

caibinhbong

New member
Cam ơn các anh chị nhá, qua đấy em biết trình độ các anh chị đến đâu. Toàn một lũ vẹt trừ hai người ít vẹt nhất là Hiển và Hưng.

Nếu anh chị muốn mình vẹt đến đâu thì đừng khóa nick trong vòng 48 tiếng em sẽ chỉ cho anh vị biết là từng anh chị vẹt như thế nào.

Còn anh chị khóa nick em thì kệ xác các anh chị, em ứ quan tâm đâu, em tin là sự vẹt các anh chị còn dài dài.
 
Cam ơn các anh chị nhá, qua đấy em biết trình độ các anh chị đến đâu. Toàn một lũ vẹt trừ hai người ít vẹt nhất là Hiển và Hưng.

Nếu anh chị muốn mình vẹt đến đâu thì đừng khóa nick trong vòng 48 tiếng em sẽ chỉ cho anh vị biết là từng anh chị vẹt như thế nào.

Còn anh chị khóa nick em thì kệ xác các anh chị, em ứ quan tâm đâu, em tin là sự vẹt các anh chị còn dài dài.
thấy kiểu hỏi từ đầu và với ông thầy kỳ lạ mình đã nghi nghi là chả có thầy nào như thế, đấy là tự bịa để thử...thầm đoán mò thế mà hóa ra đúng !!!:lol::banbo:pặc pặc:dapchet: chơi nhau kiểu này thì chết..., nhưng vừa đấm vừa xoa đúng chỗ thế đảm bảo nick vẫn y nguyên
 
Cam ơn các anh chị nhá, qua đấy em biết trình độ các anh chị đến đâu. Toàn một lũ vẹt trừ hai người ít vẹt nhất là Hiển và Hưng.

Nếu anh chị muốn mình vẹt đến đâu thì đừng khóa nick trong vòng 48 tiếng em sẽ chỉ cho anh vị biết là từng anh chị vẹt như thế nào.

Còn anh chị khóa nick em thì kệ xác các anh chị, em ứ quan tâm đâu, em tin là sự vẹt các anh chị còn dài dài.

Hồi hộp chờ xem ... :bithuong:
 

cherry

Member
Các anh chị ơi giúp bọn em với.

Thầy em cho em hai cái chương trình PCR như thế này

CT1

Biến tính 95 dộ trong 3 phút,
Chạy 30 vòng theo thông số sau:
- Biến tính 95 độ trong 2 phút
- kết dính 45 độ trong 2 phút
- tổng hợp ở 68 độ trong 3 phút

CT2

Biến tính 95 dộ trong 3 phút,
Chạy 30 vòng theo thông số sau:
- Biến tính 95 độ trong 2 phút
- kết dính 52 độ trong 2 phút
- tổng hợp ở 68 độ trong 3 phút

CT 2 giống CT1 chỉ khác là nhiệt độ kết dính là 52 độ thay vì 45 độ.

Thầy hỏi là giải thích cơ sở chọn lựa nhiệt độ ở quá trình kết dính, khi nào chọn nhiệt độ cao, khi nào chọn nhiệt độ thấp (ví dụ như 52 và 45 độ như ở trên).


Thầy còn có thêm bài tập là cơ sở hoạt động của máy đọc trình tự LiCor và ABI3730. Em có biết gì về hai máy này đâu.


Các anh chị giúp bọn em với nhá.
Buồn cho bạn quá, không biết bạn la TS hay GS hay ....
 
kệ, khóa nick làm gì, biết đâu đồng chí này cũng là vẹt, đọc được đâu đấy bài báo hay quyển sách này có nọi dung liên qua rồi thử anh em, chứ chưa chắc là hiểu hết,hiểu kỹ ( rồi thử làm PCR có ra không mới là quan trọng) mà ai mà chả nói theo sách vở, nhất là người vn, chứ có ai tự tìm ra, phat minh ra, sáng tạo ra đâu mà bảo là không nói theo lý thuyết, mà cứ bảo theo sách để nói là vẹt thi chả có ai trong này là không vẹt. bắt tay vào làm đi, lên gel rồi nhìn thấy mới thích, nói thì ai cũng đúng , làm thì ah ...sáng cả một mảng không thì...tối thui..:lol::banbo::hihi:
 

caibinhbong

New member
thầy khen tụi em vẹt nhanh giống thầy đó.
Cam đoan thầy này chưa chạy PCR bao giờ. annealing time làm gì tới cả phút thế?

Trước hết em có ý kiến về anh này.

Thưa anh gần như 90% Giáo viên dạy sinh học ở VN chưa từng làm thí nghiệm với các enzyme cắt giới hạn và cũng chả đọc đến những tài liệu chuyên sâu về vấn đề này nhưng họ vẫn dạy bài này ngon lành đó thôi.


Ở cấp đại học VN cũng vậy, ví dụ Giảng viên môn sinh lý động vật lên giảng về tim người nghe cứ ro ro. Rồi sau đó ông í giảng về hô hấp nghe cũng đã lỗ tai, cuối cùng ông giảng về sinh học sinh sản thiệt đã. Vậy sao hả anh Lương? Ông có cần là "đồ tể" moi tim gan óc phèo phổi con người trước khi lên lớp không? Ở đây đang nói về ngành sinh học chứ không phải y học anh nhá, đừng lôi trường y ra dọa em nghen.

Còn anh muốn biết vì sao annealing temperature đến cả phút thì anh chịu khó coi lại cái cuốn sách mà anh đã thảy lên đây hoặc chờ tí, mai mốt em sẽ nói đến đó anh nhé.


Em viết nếu có chi không đúng, anh bỏ quá cho em nhé.

Em viết có tí mà đôi tay ngọc ngà em mỏi rồi, mai em làm tiếp nghen mấy anh.
 

nalsinhk

Member
may quá em cũng chưa vào bốc phét tí nào cả. chứ không thì... sợ quá. công nhận là một số anh chị em cũng hay chém gió tí thôi, cũng tại ai cũng nghĩ là "cao thủ" này hỏi thật, chứ đâu biết là hỏi với mục đích thế này thế kia. buồn nhỉ.

@ caibinhbong: nói thật là cái đề bài của bạn nó chả ra cái gì cả, quá chung chung, thành ra với những người làm nhiều, sẽ thấy rất nhiều cái để nói bởi vì càng làm nhiều càng thấy nhiều vấn đề, làm ít hay không làm thì chỉ nói theo lý thuyết thôi. đề bài của bạn quá dở nên đừng có nhận xét này nhận xét nọ. nếu bạn muốn thể hiện thì nên vào thẳng câu hỏi và câu trả lời(nếu có) của bạn đi, và tôi chắc bạn cũng chỉ lý thuyết thôi (không biết là có SUÔNG không nữa-hãy chờ xem). nhân tiện nếu bạn giỏi vậy thì hãy cho tôi công thức chính xác (không nói chung chung đâu nhé, cũng đừng nói đến mấy cái như vẹt nhé ) của các thành phần trong phản ứng PCR nhé xem quan hệ của chúng nó thế nào với nhau. cảm ơn:eek:
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Trước hết em có ý kiến về anh này.

Thưa anh gần như 90% Giáo viên dạy sinh học ở VN chưa từng làm thí nghiệm với các enzyme cắt giới hạn và cũng chả đọc đến những tài liệu chuyên sâu về vấn đề này nhưng họ vẫn dạy bài này ngon lành đó thôi.


Ở cấp đại học VN cũng vậy, ví dụ Giảng viên môn sinh lý động vật lên giảng về tim người nghe cứ ro ro. Rồi sau đó ông í giảng về hô hấp nghe cũng đã lỗ tai, cuối cùng ông giảng về sinh học sinh sản thiệt đã. Vậy sao hả anh Lương? Ông có cần là "đồ tể" moi tim gan óc phèo phổi con người trước khi lên lớp không? Ở đây đang nói về ngành sinh học chứ không phải y học anh nhá, đừng lôi trường y ra dọa em nghen.

Còn anh muốn biết vì sao annealing temperature đến cả phút thì anh chịu khó coi lại cái cuốn sách mà anh đã thảy lên đây hoặc chờ tí, mai mốt em sẽ nói đến đó anh nhé.


Em viết nếu có chi không đúng, anh bỏ quá cho em nhé.

Em viết có tí mà đôi tay ngọc ngà em mỏi rồi, mai em làm tiếp nghen mấy anh.
Góp ý với đồng chí một chút, đừng làm cái topic đang bổ ích thành ra vô bổ như vậy.

1. Tôi không thấy vấn đề gì trong việc nhận xét 1 giáo viên chưa làm thực nghiệm bao giờ thông qua những gì họ thể hiện. Trên thực tế nhận xét đó có thể đúng, có thể sai, đâu cần phải cay cú đến vậy?

2. Bạn có công mở ra một thảo luận hay, mong bạn nêu ý kiến của mình để mọi người học hỏi. Tôi tin nếu như bạn đưa ra chính kiến hợp lý rồi mắng mỏ mọi người thiếu hiểu biết thế nào cũng được, chứ làm ngược lại thì e không ổn. Nếu bạn vẫn tiếp tục làm ngược như vậy thì bản thân tôi cũng chấp nhận làm vẹt cả đời mà không muốn nghe những lý giải của bạn nữa ok? Khi đó, tất cả những cái vô bổ sẽ được xoá khỏi topic này.

3. Thật ra tôi không thấy hiểu sâu hiểu kỹ hay hiểu vẹt về kỹ thuật PCR này có gì ghê gớm cả. Bản thân tôi tham gia topic này vì thấy có thể có ích cho một số bạn sinh viên. Chứ nếu các vị ở đây muốn khoe trình độ thì chắc sẽ không bao giờ chọn cái quá cơ bản như vậy. Đây chỉ là 1 bước cơ bản không thể cơ bản hơn, chẳng thấy có paper chất lượng nào mà tác giả khoe rằng đã dày công nghiên cứu và thực hiện kỹ thuật PCR để clone hay đột biến hay .... 1 gene nào đó cả.

Thân ái,
 

Facebook

Top