Giới thiệu về kỹ thuật tái tổ hợp trong gen (DNA-shuffling)
Phương pháp tái tổ hợp trong gen (hay còn gọi là sexual-PCR, family shuffling) là một phương pháp được tiến hành invitro nhờ phản ứng PCR nhằm tạo ra một ngân hàng gen lai, qua đó người ta có thể lựa chọn các dòng gen phù hợp với mục đích nghiên cứu.
Phương pháp tái tổ hợp trong gen đã được ứng dụng thành công trong nhiều lĩnh vực như: chế tạo chất kháng sinh, vacxin, làm tăng hoạt tính của enzyme hay là tạo ra các protein có chức năng khác nhau từ các đột biến không có chức năng.
Nguyên lý của phương pháp tái tổ hợp trong gen (được trình bày trên hình 1) là sự tái tổ hợp lại các dòng gen có độ tương đồng cao nhằm tạo ra các dòng gen có tính chất thay đổi, trên cơ sở đó ta chọn những dòng có hoạt tính tăng. Cụ thể, một tập hợp các đột biến của một gen, hoặc một họ các gen có độ tương đồng cao từ các sinh vật khác nhau hoặc được chọn lọc từ ngân hàng gen đã được tạo ra bằng phương pháp Error-prone PCR được sử dụng làm mẫu. Các gen này sẽ được cắt bằng Endonuclease (ví dụ: Dnase I) thành các đoạn nhỏ có kích thước khác nhau. Sau đó, các đoạn có kích thước phù hợp (khoảng ≈ 50 bp) sẽ được chọn để làm mẫu cho phản ứng PCR tự mồi (tức là PCR không sử dụng mồi, mà mồi (cũng là template) chính là các đoạn nhỏ đó). Giai đoạn gắn mồi trong phản ứng PCR tự mồi được tiến hành ở nhiệt độ gắn mồi thấp (khoảng 45-50[sup:96358d5788]0[/sup:96358d5788]C nhằm tạo điều kiện cho các sợi đơn tương đồng bắt cặp chéo với nhau và kéo dài. Sự bắt cặp chéo tương đồng và kéo dài của các đoạn được tiếp tục diễn ra ở các chu kỳ sau. Cứ mỗi chu kỳ thì kích thước trung bình của mỗi đoạn được dài thêm. Quá trình PCR được tiếp tục cho đến khi đạt được đoạn có kích thước bằng với kích thước chuẩn ban đầu. Với mong muốn đạt được kích thước chuẩn này, người ta thường gắn thêm vào 2 đầu gen một đoạn nucleotide để khi quá trình bắt cặp tương đồng và kéo dài đến đoạn nuleotide này thì dừng lại vì không có mồi tương đồng bắt cặp nữa.
Sản phẩm của lần PCR tự mồi này được dùng làm mẫu cho phản ứng PCR có mồi nhằm làm tăng số lượng bản sao mong muốn. Cuối cùng, một ngân hàng gen lai được tạo ra với độ đa dạng cao. Trong ngân hàng gen này có thể có các tổ hợp gen mà ta mong muốn. Toàn bộ quá trình có thể được lặp đi lặp lại nhiều lần cho đến khi đặt được kết quả tốt nhất (hình 2).
Khuyết điểm: hiệu xuất để tạo ra các sản phẩm gen mong muốn còn thấp. Tỉ lệ các gen không được shuffling còn cao (giống với nguồn gen ban đầu).
Trên đây là kiến thức cơ bản về DNA-shuffling. Hiện tại, các nhà khoa học đã phát triển nhiều phương pháp mới để hạn chế các khuyết điểm trên. Hai trong số đó là Degenerate oligonucleotide gene shuffling (DOGS) (tài liệu kèm theo) và phương pháp thiết kế primer có chứa những vùng có thể tạo đột biến ngẫu nhiên (như Khôn đang làm)
Trở lại câu hỏi của bạn:
- Về mặt suy luận: nếu bạn chỉ chạy PCR 1 lần thì tạo ra một vùng smear (còn smear có kéo dài từ trên xuống dưới bản gel agarose hay không thì còn phụ thuộc vào nhiều thứ…..có thể kiểm tra bằng thực nghiệm. Vì lúc này sự bắt cặp của mồi là rất ngẫu nhiên).
- Nếu bạn dừng thí nghiệm ở đây thì chưa đi hết thí nghiệm. Bạn sẽ phải tiến hành PCR lần 2. Các bước thí nghiệm theo mình nghĩ sẽ như sau:
+ PCR lần 1 ----- chạy điện di và cắt ngay một vùng smear xung quanh kích thước mà bạn mong muốn làm template (ở đây là ≈ 500bp) (và thử thêm trường hợp lấy cả hỗn hợp PCR lần 1 làm template) --- PCR lần 2: ở lần PCR này thì chỉ cần dùng 1 cặp mồi ở 2 đầu gen (mà bạn đã thiết kế các điểm cắt enzyme giới hạn như hình vẽ). Về mặt lý thuyết, đến đây thì bạn có thể thu được sản phẩm gen mong muốn (nhưng cũng ko nhất thiết là phải ra một băng đâu nhé, thực nghiệm có thể sẽ ra vài băng).
Trên đây là một số góp ý cho thí nghiệm của bạn. Có điều lý thuyết vẫn là lý thuyết, cần có thực nghiệm chứng minh và bổ sung.
Trong qua trình làm, nếu sáng tỏ được điều gì thì bổ sung vào đây.
Ở Việt Nam, có TS. TRƯƠNG NAM HẢI, phòng KTDT - Viện CNSH cũng đã từng làm DNA-shuffling.
Thân chào.