Một số ứng dụng của PCR trong vi sinh vật
?
?Trong vi sinh vật, PCR (Polymerase Chain Reaction) được ứng dụng rất sớm và ngày càng rộng rãi để chẩn đoán cǎn nguyên của các bệnh nhiễm trùng, để tìm hiểu sâu hơn về cơ chế gây bệnh của chúng và để phân loại chúng một cách chi tiết và chính xác hơn.
Trong vi sinh vật, PCR (Polymerase Chain Reaction) được ứng dụng rất sớm và ngày càng rộng rãi để chẩn đoán cǎn nguyên của các bệnh nhiễm trùng, để tìm hiểu sâu hơn về cơ chế gây bệnh của chúng và để phân loại chúng một cách chi tiết và chính xác hơn. Có thể kể tóm tắt một số ứng dụng chính của PCR trong Vi sinh vật học như sau:
1. Xác định cǎn nguyên của các bệnh nhiễm trùng.
Cǎn cứ vào các đặc điểm (tính trạng) thường gặp nhất của các vi sinh vật được quan tâm, người ta tìm đến các gen quyết định các tính trạng đó, thiết kế một bộ gen mồi (primer) phù hợp nhằm để khuyếch đại một vùng ổn định nào đó trên bộ gen nói trên. Sản phẩm của quá trình khuyếch đại sau này, vì vậy, đã được xác định (cả về độ dài và trình tự các nucleotide) ngay từ giai đoạn này.
Khi đưa bộ gen mồi nói trên vào một hỗn hợp ADN đã được tách chiết từ vi sinh vật, nếu ADN này có chứa các đoạn gen có trình tự các nucleotide bổ sung với trình tự của gen mồi thì chúng sẽ cặp đôi với nhau và, sau đó, gen mồi được kéo dài về phía đầu 3' của nó nhờ ADN polymerase. Đoạn ADN đó, nhờ vậy, sẽ được nhân lên một cách đặc hiệu rất nhiều lần; sau quá trình nhân lên, người ta sẽ tìm đoạn ADN này, thông thường nhất, bằng điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethidium bromide. Như vậy, sau khi điện di, nếu có bǎng ADN chạy giống như bǎng chuẩn thì điều đó có nghĩa là có vi sinh vật cần tìm trong bệnh phẩm; ngược lại, nếu không thấy bǎng nào xuất hiện hoặc có những bǎng không giống với bǎng chuẩn thì có nghĩa là không có tác nhân gây bệnh cần tìm trong bệnh phẩm.
Dựa trên nguyên tắc này, hiện nay, hầu như tất cả các vi sinh vật gây bệnh đều có thể tìm được nhờ PCR. Sau đây là một số ứng dụng điển hình:
• Dùng PCR cho những vi sinh vật chưa nuôi cấy nhân tạo được hoặc nuôi cấy rất khó khǎn:
. Các xoắn khuẩn: tất cả các xoắn khuẩn đều khó nuôi cấy.
Tác nhân gây bệnh giang mai (Treponema pallidum), hiện nay vẫn chưa nuôi cấy nhân tạo được. Người ta có thể dùng nước ối từ mẹ làm bệnh phẩm cho PCR (1). Nhờ vậy, giang mai bẩm sinh có thể được chẩn đoán rất sớm.
Người ta cũng đã dùng PCR để tìm gen mã hoá cho protein màng ngoài (2) hoặc một đoạn 419-bp (3) của gen mã hoá protein lông của các tác nhân gây bệnh Lyme (Borrelia burgdorferi). Bằng cách đó, bệnh Lyme có thể được chẩn đoán sớm và chính xác.
. Các tác nhân gây bệnh đường sinh dục: Tác nhân gây bệnh lậu và các viêm niệu đạo sau lậu để khó nuôi cấy.
Neisseria gonorrhoeae (4) và các tác nhân thường gây viêm niệu đạo sau lậu (Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum và Mycoplasma genitalium) đã có thể đồng thời tìm được trong một ống PCR duy nhất với bệnh phẩm là nước tiểu (5). Điều này không những mang lại lợi ích thiết thực cho bệnh nhân mà còn góp phần đắc lực cho nghiên cứu, tìm hiểu, đánh giá tình hình bệnh một cách sát thực hơn, do trước đây không có điều kiện nuôi cấy tìm cǎn nguyên gây bệnh.
. Vi khuẩn lao:
Mycobacterium tuberculosis không phải là quá khó nuôi cấy; tuy vậy, chúng mọc rất chậm (thời gian nhân đôi từ 14 - 15 giờ, so với E. coli, khoảng 20 phút). Khoảng 2 tháng sau khi nuôi cấy mới nhìn thấy khuẩn lạc lao. Vì vậy, giá trị phục vụ lâm sàng của phương pháp nuôi cấy bị hạn chế rất nhiều. Phương pháp nhuộm soi từ bệnh phẩm thì có độ nhạy rất kém (phải có trên 105 vi khuẩn/ml đờm mới cho kết quả dương tính).
PCR đã góp phần đắc lực giải quyết việc này. Nó có thể cho kết quả trong vòng 1 - 2 ngày với độ nhạy gấp khoảng 10.000 lần so với các phương pháp cổ điển. Vì vậy, có thể chứng minh được sự có mặt của vi khuẩn lao trong dịch não tuỷ, nước tiểu và các loại bệnh phẩm chứa ít vi khuẩn mà trước đây chẩn đoán rất khó khǎn.
Ngày nay, người ta còn dùng PCR để xác định các đột biến kháng Rifamicin (dấu hiệu rất có giá trị để coi một M. tuberculosis là đa đề kháng) ở gen rpoB. Nhờ vậy, những biện pháp điều trị phù hợp được áp dụng một cách kịp thời; điều đó mang lại lợi ích không nhỏ cho bệnh nhân và cộng đồng, vì rằng những chủng vi khuẩn lao đa đề kháng đã được hạn chế tung ra môi trường bên ngoài.
. Helicobacter pylori (HP): HP hiện đang là một trong những vấn đề thời sự của Y học thế giới vì vai trò quan trọng của nó trong các bệnh lý viêm, loét và ung thư dạ dày.
Tuy vậy, nuôi cấy HP rất khó. PCR đã được dùng để tìm HP trực tiếp từ mảnh sinh thiết dạ dày, hoặc tìm các gen (VacA, CagA) liên quan tới độc tính của nó. Nhờ PCR, người ta còn biết được sự phân bố của các chủng HP khác nhau trên các vùng địa lý khác nhau hoặc các chủng HP đặc biệt liên quan mật thiết đến những tình trạng bệnh lý nhất định.
. Các vi khuẩn khác như Coxiella burnetti với mảnh 438-bp của gen mã hoá cho một protein 27kDa của màng ngoài; Salmonella typhi với mảnh 343-bp mã hoá cho protein lông và 599-bp mã hoá cho kháng nguyên Vi; Pseudomonas pseudomallei (nay là Burkholderia pseudomallei) với mảnh 517-bp của 16S ARNr cũng đã được khuyếch đại thành công bằng PCR.
. Amíp:
Dùng PCR để tìm đoạn gen mã hoá cho một protein 30.000 Mdal liên quan tới độc tính của Entamoeba histolytica, người ta có thể phân biệt được amíp gây bệnh và amíp không gây bệnh (6).
. Vi rút:
Vi rút viêm gan B (7,8), HIV, vi rút thuỷ đậu, vi rút Herpes simplex, Papillomavirus, Cytomegavirus và Enterovirus đã được chẩn đoán thành công bằng PCR.
Đối với HIV, những tài liệu đã dẫn cho thấy, PCR cho kết quả dương tính sớm hơn các dấu hiệu biến đổi về miễn dịch từ 3 - 6 tháng; đặc biệt là nó cho phép chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh, khi mà các kháng thể kháng HIV ở trẻ lúc này, có thể, chỉ đơn thuần là do từ mẹ truyền sang.
• Xác định độc tố của vi sinh vật:
Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli, và gần đây, các gen elta và elfB của E.coli sinh độc tố ruột (enterofoxigenic Escherichia Coli, ETEC); vt1 và vt2 của E. coli gây chảy máu đường ruột (enterohemorrhagic Escherichia coli; EHEC); eaeA và bfpA của E. côli gây bệnh đường ruột (enteropathogenic Escherichia coli; EPEC); ial của E.coli xâm nhập đường ruột (enteroinvasive Escherichia coli; EIEC) và Shigella đã được khuyếch đại bằng PCR nhằm chẩn đoán phân biệt giữa các loại Escherichia coli gây tiêu chảy.
PCR khuyếch đại các gen nói trên đã thay thế hoặc bổ sung cho các thử nghiệm kinh điển có độ nhậy và độ đặc hiệu kém hơn hoặc là thay thế cho các kỹ thuật phức tạp hơn.
Độc tố ruột của vi khuẩn tả (CT), (CT, cholera toxin) đóng vai trò chủ đạo trong cơ chế gây bệnh của chúng. PCR đã được dùng khuyếch đại đoạn gen mã hoá cho CT; nhờ đó, có thể phân biệt một cách chắc chắn Vibrio cholerae gây bệnh tả thực sự với các Vibrio cholerae khác, thuộc các nhóm huyết thanh không gây bệnh tả (trước đây gọi là các Vibrio không ngưng kết; nonagglutination, NAG).
Clostridium difficile đã được định loại thông qua xác định các loại độc tố riêng biệt của chúng bằng PCR.
• Xác định vi khuẩn ngoài môi trường:
Các vi khuẩn khó nuôi cấy và/hoặc thường có mặt ngoài môi trường có thể được tìm trực tiếp bằng PCR, ví dụ như các Legionella, Salmonella, Shigella và Vibrio cholerae.
Nói tóm lại, dùng PCR để tìm tác nhân gây bệnh đã được áp dụng rất rộng rãi. PCR có lợi thế lớn là nhanh (thời gian cần thiết cho chẩn đoán tính bằng "giờ" so với các kỹ thuật kinh điển phải tính bằng "ngày"), nhạy (độ nhạy rất cao, chỉ cần từ 10 - 1000 tế bào vi khuẩn, tuỳ theo kỹ thuật, là đủ) và độ đặc hiệu cũng rất cao. Nhờ vậy, bệnh được chẩn đoán nhanh hơn và chính xác hơn.
Giá trị chẩn đoán bệnh của PCR đặc biệt trong những trường hợp vi sinh vật không nuôi cấy được hoặc nuôi cấy rất khó khǎn, tốn kém; hoặc kết quả nuôi cấy rất chậm, hoặc ở những bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước khi vào viện, vì rằng PCR không nhất thiết đòi hỏi phải có vi sinh vật sống.
Tuy vậy,cho đến nay, do những điểm hạn chế của nó (như đòi hỏi phải có trang thiết bị và nguyên vật liệu riêng, đắt tiền; cán bộ kỹ thuật phải có trình độ nhất định; kỹ thuật thực hiện còn phức tạp), PCR chỉ bổ sung chứ không thay thế hẳn được phương pháp chẩn đoán kinh điển khác.
2. Định loại (identification) vi khuẩn
Sau khi phân lập được vi khuẩn, PCR góp phần quan trọng trong định loại chúng.
Đối với từng vi khuẩn cụ thể, qui trình cho PCR với bệnh phẩm từ lâm sàng thường giống với bệnh phẩm là vi khuẩn thuần. Tuy vậy, việc chuẩn bị ADN mẫu (template) từ vi khuẩn thuần cho PCR rất đơn giản: chỉ cần đun sôi cách thuỷ huyền dịch vi khuẩn trong 10 phút rồi thu lấy dịch nổi sau ly tâm loại bỏ tế bào là đủ.
3. Phân loại (classification) vi khuẩn
Nhờ khuyếch đại những đoạn gen phụ trách ARNr 16S, người ta có thể so sánh mối quan hệ gần gũi hay xa nhau giữa các vi khuẩn, góp phần phân loại vi khuẩn chi tiết hơn và chính xác hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Grimpel E, Sanchez PJ. et al. Use of polymerase chain reaction and rabbit infectivity testing to detect Treponema pallidum in amniotic fluid, fetal and neonatal sera and cerebrospinal fluid. J. Clin. Microbiol. 29: 1711 - 1718, 1991.
2. Rosa PA and Schuan TG. A specific and sensitive assay for the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi using polymerase chain reaction. J. Infect. Dis. 160: 1018 - 1029, 1989.
3. Wise DJ and Weave TL. Detection of Lyme disease bacterium. Borrelia burgdorferi, by using the polymerase chain reaction and a nonradioisotopic gene probe. J. Clin. Microbiol. 29: 1523 - 1526, 1991.
4. Mahony JB. et al. Multiplex polymerase chain reaction for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in genitourinary specimens. J. Clin. Microbiol. 33: 3049 - 3053, 1995.
5. Mahony JB. et al. Detection of Chlamydia trachomatis. Neisseria gonorrhoeae, Ureaplasma urealyticum, and Mycoplasma genitalium in first-void urine specimens by multiplex polymerase chain reaction. Mol. Diagn. 2 (3): 161 - 168, 1997.
6. Tachibana H, Ihara S and Kobayashi S, Et al. Differences in genomic DNA sequences between pathogenic and nonpathogenic isolates of Entamoeba histolytica identified by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 29: 2234 - 2239, 1991.
7. Yokosuka O, Tagawa M and Omata M. Polymerase chain reaction. detection of hepatitis B. Viral pathogens. 322 - 326. 1992.
8. Baginski I, Ferrie A. et al. Detection of Hepatitis B virus.. In: Innis MA, Gelfand DH et al (Eds). A guide to methods and applications. Academic Press, Inc. Harcount Brace Jovanovich Pub. 348 - 355, 1990.
Lê Văn Phủng
Update 7/8/2004
http://www.hmu.edu.vn/tiengviet/content.asp?Code=561&id=NetTraining&idlg=Vietnam