What's new

Sơ lược về khối phổ (mass spectrometry)

Dương Văn Cường

Administrator
#1
Chức năng của máy khối phổ:

- Xác định khối lượng protein
- Xác định trình tự protein.



Tại sao cần đến Khối phổ (Mass spectrum)?

- Thông thường sau khi biểu hiện 1 gen người ta có thể thu được một protein. Nếu dừng ở mức độ điện di trên gel acryllamide thì ta chỉ biết được về khối lượng của protein theo các băng và không thể khẳng định một cách chắc chắn rằng băng đó, theo lý thuyết trùng với khối lượng protein cần biểu hiện, chính là protein mong muốn. Làm western blot có thể khẳng định chắc chắn hơn. Tuy nhiên, không phải mọi protein đều có thể có kháng thể (hoặc kháng nguyên) tương ứng, hoặc nếu có thì phải mất nhiều công sức + thời gian gây miễn dịch, tinh chế kháng nguyên … để dung cho western blot.

- Phương pháp khối phổ có thể khẳng định được chính xác protein.



Nguyên lý hoạt động của máy khối phổ:

Cấu tạo:
Máy gồm một đĩa đựng mẫu, máy bắn laser, một ống tròn đảo chiều điện cực liên tục và detector. Bà con có thể sử dụng chức năng tìm kiếm hình ảnh của google để ngó qua mặt mũi mấy cái máy khối phổ. Có rất nhiều (khoảng 20 loại) máy với những thiết kế chuyên biệt khác nhau.

Hoạt động:

Đầu tiên protein được tinh chế theo quy trình, cắt bằng enzyme pepsin rồi đưa vào máy. Enzyme pepsin cắt polypeptide tại những điểm nhất định trên chuỗi (giống enzyme giới hạn ở acid nucleic). Vì ta biết trước trình tự của protein quan tâm nên có thể dự đoán được các mảnh (fragments) polypeptide sau khi bị cắt.
Đưa mẫu đã xử lý pepsin vào đĩa và cho máy chạy. Laser bắn vào đĩa sẽ ion hoá các fragments (làm cho chúng tích điện dương) và làm cho chúng bật ra bay vào ống. Ống này có chiều dài nhất định, 4 phía gắn 2 loại điện cực (+) và (-) và ống có thể xoay tròn, do đó các cực điện đổi chiều lien tục làm cho các mảnh polypeptide không bám được vào thành mà bay theo chiều xoắn ốc. Vận tốc bay của 1fragment phụ thuộc 2 yếu tố là điện tích (z) và khối lượng (m) của nó. Máy khối phổ đo được thời gian, biết trước quãng đường => tính được vận tốc => xác định được chỉ số m/z của fragment. Các tín hiệu được phát hiện bởi detector và khuếch đại, cuối cùng biểu diễn trên đồ thị ở dạng các đỉnh (pick). Mỗi đỉnh tương ứng 1 fragment.

Đó là đối với máy MS. Với máy MS/MS (tandem MS) thì đây mới là lần MS thứ nhất, cho phép hiển thị các fragment của một polypeptide bị cắt bằng pepsin. Lần MS thứ 2 cho phép khẳng định chắc chắn 1 fragment nhất định nhờ hệ thống lọc. Ta có thể thiết lập (setup) chương trình sao cho máy loại bỏ tất cả các fragments khác và chỉ cho fragment mong muốn đi qua.

Phân tích kết quả:

- Thứ nhất: Từ chỉ số m/z của các đoạn polypeptide có kích thước đủ nhỏ, người ta có thể xác định trước các trình tự đó và lập thành cơ sở dữ liệu (database). Vì protein bao gồm 20 amino acid có khối lượng khác nhau do đó khối lượng của một trình tự đủ nhó nói lên được trình tự của nó. (Giả sử Valin có khối lượng là 3, methionin là 5 thì một fragment có khối lượng là 8 sẽ có trình tự Valin – Methionin hoặc Methionin – Valin).

- Thứ 2 là phổ cắt của đoạn polypeptide cũng có ý nghĩa.

- Thứ 3 là sự hỗ trợ của genomics.


+++++++++++++++++++++++++


- Hồi tôi đi công tác một tỉnh miền núi phía bắc, buồn đời mở internet tìm hiểu linh tinh về khối phổ và có ghi lại dăm điều theo ý hiểu của mình vào sổ. Lúc về không copy lại mấy cái tài liệu đó => đây là lý do mà tôi không thể trích dẫn tài liệu tham khảo của bài này.

- Với khối phổ tôi chỉ cưỡi ngựa xem hoa. Mục đích viết bài này để khơi mào vấn đề thôi, chứ không đủ khả năng trả lời các câu hỏi.

- Ở Viện CNSH có một hệ thống khối phổ của AB đặt ở phòng chú Phan Văn Chi. Hình như là một mình cái hệ thống này chiếm mất 1 phòng :oops:

- Tìm trên els.net có ra 3 bài mà tiêu đề có vẻ rất cơ bản về khối phổ, nếu anh lonxon có thể lấy về và đưa vào chương trình mỗi tuần 1 bài els thì hay quá:
1. Mass Spectrometry in Biology
2. Mass Spectrometry: Analysis of Two-dimensional Protein Gels
3. Mass Spectrometry: Peptide Sequencing
 

Cao Xuân Hiếu

Administrator
Tôi cũng làm về MS nhưng mà chắc ko thể chuyên nghiệp bằng các bạn bên ngành Hóa. Máy khối phổ dùng cho proteomics chỉ là 1 ứng dụng rất nhỏ. Tuy nhiên, nó cho bạn câu trả lời chính xác là gene đấy có cho ra protein ko? hay là identification. Điều bắt buộc để tiếp cận vấn đề theo hướng này là genomics phải được giải mã hoàn toàn và phải dự đoán các ORF nhờ bioinformatics.
 
Anh Cường có thể giải thích rõ dùm em:
1. Từ (m/z) có được, làm sao tính được m, z riêng?
2. Trong một hỗn hợp ~ 999 (protein + polypeptide) => cần tinh chế mẫu thế nào để đưa vào máy => để phát hiện 1 polypeptide mới, *điện di 2D cũng không phát hiện được polypeptide đó.
 

Cao Xuân Hiếu

Administrator
Vũ Hải Chi said:
Anh Cường có thể giải thích rõ dùm em:
1. Từ (m/z) có được, làm sao tính được m, z riêng?
2. Trong một hỗn hợp ~ 999 (protein + polypeptide) => cần tinh chế mẫu thế nào để đưa vào máy => để phát hiện 1 polypeptide mới, *điện di 2D cũng không phát hiện được polypeptide đó.
1. Mọi máy MS trong proteomics đều cho ra m/z. Tuy nhiên tùy vào loại Sector gì mà có cách cho ra giá trị m. Máy đơn giản nhất là là TOF (time of flight) với nguyên lý tại đây http://en.wikipedia.org/wiki/Time-of-flight . Ngoài TOF ra thì có các loại sector khác như ?quadrupole ion trap, quadrupole và FT-ICR. Trong SHVN người có nhiều kinh nghiệm về MS chắc là Trương Quốc Phong.

2. Thứ nhất là làm thế nào em biết điện di 2D không phát hiện được polypeptide đó? Tuy nhiên nếu không thích dùng 2D có thể chạy nHPLC rồi lấy các fractions cho vào MALDI MS/MS hoặc FT-ICR thì chắc chắn detect được polypeptide đó. Cái đấy gọi chung là gel-free proteomics. Có cái method mới với cái tên cũng khá kêu như 2D-LC dùng iTRAQ của nhóm tôi (http://www.mcponline.org/cgi/content/full/5/7/1183)
 
Cao Xuân Hiếu said:
1. Đấy là ion biết điện tích, cá chuỗi a.a dài ngắn khác nhau, tính điện tích của thế nào được nhỉ? Vẫn không hiểu, phải xem lại kỹ vậy.
2. Hỗn hợp mẫu ít, polypeptide đó lượng "hiếm" điện di 2D không thấy là chuyện bình thường. Té ra phải dùng sắc ký tách, em cứ tưởng cho cả đống ~999 đó vào ?:oops: .
# ? đại ca Hiếu đi chơi đâu mà, post bài nhanh thế.
 

Dương Văn Cường

Administrator
Ngoài anh Phong còn có Vũ Minh Thiết (mới đăng ký) cũng có kinh nghiệm làm việc và hiện đang tiếp tục làm PhD trong lĩnh vực này.
 
Dương Văn Cường said:
Ngoài anh Phong còn có Vũ Minh Thiết (mới đăng ký) cũng có kinh nghiệm làm việc và hiện đang tiếp tục làm PhD trong lĩnh vực này.
Anh Thiết dạo này thế nào rồi nhỉ? Anh viết một bài về MS để anh em học hỏi chút đi ?:p .
 
Chào anh em

Giờ mình đã không làm về proteomics theo hướng MS và gel based nữa rồi, nhưng khi nào rỗi sẽ viết một bài rõ ràng 1 tí. Giờ mình đã chuyển sang làm proteomics theo hướng chemical biology.

Hiện ở VN cũng có khá nhiều lab có máy khối phổ nhưng ứng dụng vào proteomics thì chưa nhiều lắm, ở trường ĐHKHTN Hà Nội giờ có hẳn 1 phòng trọng điểm proteomics đấy, nhưng hình như là máy của Shimazhu, còn máy MS ở Viện CNSH là của Applied Biosystem QSTAR XL, máy có thể dùng với nhiều nguồn tạo ion khác nhau (cả MALDI và ESI).

Còn để biết được m và z từ m/z thì một phần còn phụ thuộc vào phương pháp ion hóa, với MALDI thì peptide thường tích điện +1 (khi máy chạy ở positive mode), thì sẽ dễ dàng deduce ra mass của peptide; ?hoặc đa ion với ESI (+2, +3, …+n), rồi dựa trên chênh lệch khối lượng giữa các ion có độ tích điện khác nhau sẽ tính được khối lượng m. Máy khối phổ không đo m mà chỉ đo m/z, nên 1 phân tử có m=500, tích điên +1 và một phân tử có m=10000 tích điện + 20 thì có same behavior trong máy khối phổ. Ví thế mà người ta có thể dùng MS với ESI để đo khối lượng phân tử rất lớn, mặc dù ngưỡng phát hiện của máy chỉ khoảng vài nghìn Dalton. Sơ sơ là vậy.

Về MS trong chẩn đoán thì chưa rõ là có chưa, chỉ biết hiện giờ ở Singapore có một số bệnh viện đều có máy MS, nhưng chắc chỉ để nghiên cứu, mới đây thấy có một bệnh viện về mắt (eye) ở Singapore lại tuyển postdoc làm về MS. Hiện giờ phương pháp MS trong chẩn đoán vẫn chưa thành chuẩn được, để dùng trong chẩn đoán, vì nó chỉ là phương pháp xác định khối lượng thôi, như anh Hiếu nói, nó chỉ thật sự mạnh khi kết hợp với database của genomics và các công cụ của bioinformatic. Nhưng thật sự là MS rất mạnh và ứng dụng rất lớn.

Mình sẽ cố gắng post một bài MS chi tiết sau.

Rất mong forum này sẽ phát triển hơn nữa.

P/S: dạo này Cường khỏe không, Anh Hiếu đang làm gì mà dùng tới ITRAQ vậy, giờ em từ bỏ khối phổ rồi, nên chắc giờ Anh Hiếu phải expertise làm rồi chứ.
 
Hiện ở VN cũng có khá nhiều lab có máy khối phổ nhưng ứng dụng vào proteomics thì chưa nhiều lắm, ở trường ĐHKHTN Hà Nội giờ có hẳn 1 phòng trọng điểm proteomics đấy, nhưng hình như là máy của Shimazhu, còn máy MS ở Viện CNSH là của Applied Biosystem QSTAR XL, máy có thể dùng với nhiều nguồn tạo ion khác nhau (cả MALDI và ESI).

Phòng trọng điểm Proteomics của trường ĐHKHTN Hà Nội thuộc khối phòng trọng điểm về Protein và Enzyme
Phòng hiện sử dụng máy MALDI-TOF/TOF của Shimazhu (model nào thì em cũng không nhớ rõ lắm). Vì phòng làm với 2DE nên kết hợp với hệ thống này là thích hợp nhất (lí do vì sao thì em xin phép được trả lời trong 1 bài cụ thể)
 
Em xin giới thiệu 1 tài liệu rất cơ bản giới thiệu về máy khối phổ: từ cấu tạo, nguyên lý hoạt động cho đến các hệ thống máy phổ biến hiện nay. Em nghĩ tài liệu này có thể trả lời đầy đủ cho các câu hỏi của các anh các chị trong topic này
http://www.astbury.leeds.ac.uk/facil/MStut/mstutorial.htm
Sau đó nếu ai có câu hỏi gì thêm, nếu có thể em sẽ cố gắng trả lời
 
Anh Cường có thể giải thích rõ dùm em:
1. Từ (m/z) có được, làm sao tính được m, z riêng?
2. Trong một hỗn hợp ~ 999 (protein + polypeptide) => cần tinh chế mẫu thế nào để đưa vào máy => để phát hiện 1 polypeptide mới, *điện di 2D cũng không phát hiện được polypeptide đó.

Bất kỳ máy MS nào đều đo M/z, đặc biệt đối với các electrospray, tất cả các peptide trước khi đi qua orifice (miệng của Ion Trap) đều đã được proton hóa vì thế trọng lượng phân tử của chúng luôn ở dạng (m+zH)
Vi rằng trong tự nhiên có khoảng 99% carbon ở đồng vị 12C và khoảng 1% ở dạng đồng vị 13C do đó full MS của bất kỳ một peptide nào đểu có chứa nhiều hơn một peak. số lượng các peak mà ta có thể quan sát được phụ thuộc vào số nguyên tử carbon có trong phân tử peptide đó (điều này giải thích chi tiết tương đối phúc tạp).
Vì rằng tất cả các peptide đều được proton hóa ỏ dạng (m+zH) nên các peak liền kề gây ra bởi sự có mặt của 13C sẽ có khoảng cách tương ứng là 1/z nên z của một phân tử nhất định có thể được xác định một cách trực quan
nên nếu tỷ số đó là 1/2 => z =2, 1/3=> z=3........, bạn tự tính tiếp được
Tuy nhiên việc làm này chỉ phù hơp khi ta quan tâm đến một peptide của thẻ nào đó, còn khi lam proteomics input la hàng vạn peptide thi cần có thuật toán để xác định M/z , tiên phong vè lĩnh vục proteomics có cac lab sau ma ban co thể thao khao:
John Yate, Scrippt Reseach Institute, California lab này chuyen develop các thuật toán va software applicabe in proteomics. http://www.scripps.edu/research/faculty.php?rec_id=7834 Sequest agrorithm là sản phẩm của lab này

Hoặc Mathias Mann, tai max Planck Isntitute for biochemistry http://www.biochem.mpg.de/en/rd/mann/index.html
ông này là cha để của proteomic hiên đại, ông là người đầu tiên sequence được một peptide, Ông cũng là người phát minh ra phương pháp SILAC (stable isotope labelling of amino acid in cell culture) và các phàn mền (thuật toán đi kèm như MSquant, Maxquant, đây đều là các free ware được publish trên journal of proteme research va nature biotechnology ) bạn có thể download free

Về câu hỏi thứ 2 của bạn mình chua hiểu lắm,

Mình thấy thế này, các khó của proteomics la lam sao đinh lượng được peptide hay protein, hiện nay các thuật toán và phần mên tương ứng chỉ cho phép làm bán định lượng ( comparative quantification) nhưng để đinh lượng tuyệt đối ( vi dụ trả lời xem có bao nhiêu mole , gram của các protein trong một mẫu là điều chưa thể làm được và mình cho ràng đó la rào cản cho việc ưng dụng MS proteomics vào clinic dionogsis).
Việc phân tích một mẫu protein mixture nào đó bằng phương pháp MS không khó, nhưng xử lý so liệu sau phân tích tương đối phúc tạp, người làm MS proteomics khác với một ky thuật viên ở chỗ có hiểu biết kỹ về thống kê, và xủ lý được số liệu sau phân tich.
 
Bạn Cường cho rằng
Nguyên lý hoạt động của máy khối phổ:

Cấu tạo:
Máy gồm một đĩa đựng mẫu, máy bắn laser, một ống tròn đảo chiều điện cực liên tục và detector. Bà con có thể sử dụng chức năng tìm kiếm hình ảnh của google để ngó qua mặt mũi mấy cái máy khối phổ. Có rất nhiều (khoảng 20 loại) máy với những thiết kế chuyên biệt khác nhau.


Mình chắc bạn mới tìm hiểu về MS nên mới đưa ra nhận xét nhu trên, vì điều này chỉ đúng đối với phần ionisation method, (thường đi kèm với MALDI) chứ hoàn toàn sai khi MS là Ion Trap hay Orbitrap....
 

Facebook

Top